Proyecto Genoma Bioinformática

En este proyecto analizaremos datos de secuenciación de Escherichia coli obtenidos de un ensayo de evolución experimental. A partir de una población ancestral, las bacterias fueron sometidas a distintas condiciones de cultivo durante varias generaciones, lo que favorece la aparición de mutaciones que pueden conferir ventajas adaptativas y la comparación entre la población ancestral y las derivadas permite identificar los cambios genómicos responsables de esas adaptaciones. Para este análisis se simulará un flujo de trabajo, mostrado a continuación:

Pregunta Biológica

¿Qué cambios genómicos surgen en Escherichia coli bajo condiciones de cultivo controladas a lo largo de un experimento de evolución, y cómo estos cambios pueden estar relacionados con ventajas adaptativas en el fenotipo?

🗂 Estructura del repositorio

├── scripts/          # Scripts para la ejecución del análisis
├── quality_results/  # Reportes de calidad generados (FASTQC/MultiQC HTML)
│ ├── pre_qc/
│ ├── post_qc/
│ └── fastp/
├── assembly_results/ # scaffold.fasta + reporte QUAST
├── index/            # Archivos BAM procesados e indexados
├── informe/          # Informe PDF con análisis biológico
└── README.md         # Este archivo

🚀 Ejecución del Flujo de trabajo

Este repositorio contiene un conjunto de scripts bash que implementan un pipeline reproducible para analizar los datos de secuenciación en un contexto de evolución experimental, desde la estructura en los archivos inicial hasta el análisis de mapeo, para que este pipeline se pueda reproducir, es necesario cumplir con los siguientes prerrequisitos:

1. Crear un environment con todos los paquetes y softwares, para eso es necesesario descargar el archivo environment.yml que se encuentra en la carpeta scripts/ y correr el siguiente código en la terminal:

   conda env create -f environment.yml

2. Activar el entorno recien creado

   conda activate project_env

3. Activar los permisos de ejecución de los scripts

   chmod +x scripts/*sh

4. Ejecute cada srcipt en orden númerico. Ejemplo de código:

   ./ejemplo.sh

Script	Descripción
setup.sh	Configura la estructura de carpetas, para mantener los reportes organizados
02_pre_qc.sh	Ejecuta FastQC y MultiQC sobre las lecturas crudas.
03_trimming.sh	Aplica fastp para trimming y filtrado por calidad.
04_post_qc.sh	Ejecuta FastQC y MultiQC sobre las lecturas depuradas por calidad.
05_assemble_mapping.sh	Ensamblaje de novo con SPAdes y evaluación con Quast y alineamiento de lecturas evolucionadas con BWA + procesamiento con samtools.

Explicación de códigos y flags importantes

trimming_02

fastp comando que realiza el control de calidad para datos de secuenciación.

• --detect_adapter_for_pe
  Detecta adaptadores con algoritmos específicos para paired-end (lecturas pareadas). Por defecto, esta detección automática está desactivada para datos paired-end y activarla puede mejorar la limpieza de las secuencias.

• -qualified_quality_phred 28
  Elimina reads que tengan mas del 40 % de las bases por debajo de un valor phred de 28

• --length_required 80
  Retira cualquier lectura que tenga una longitud menor a 80 pares de bases (pb).

• --cut_front --cut_tail --cut_mean_quality 28
  Corta bases al principio y al final de la secuencia ve la calidad promedio de las 4 primeras y ultimas bases si esta esta por debajo de un valor phred de 28 las corta y analisa las siguientes 4 bases si el valor phred esta por encima continua con el siguiente

Assembly

SPAdes es un paquete que permite ensamblar genomas de novo o utilizando un genoma de referencia.

• -1 indica el archivo con las lecturas de la hebra forward (forward strand).
• -2 indica el archivo con las lecturas de la hebra reverse (reverse strand).
• --isolate es un flag recomendado para datos de Illumina; ajusta parámetros internos optimizados para lecturas Illumina y para ensamblajes de aislados bacterianos.

seqkit seq -m 100 scaffolds_anc_trimmed.fasta > filter_scaffold_anc_trimmed.fasta

Este comando elimina los scaffolds de menos de 100 pb, ya que:

• Scaffolds con menos de 100 bases no permiten identificar genes correctamente.
• Además, suelen ser más cortos que las lecturas que se mapearán sobre ellos.
• Los scaffolds filtrados (de longitud mayor o igual a 100) se guardan en un nuevo archivo FASTA (filter_scaffold_anc_trimmed.fasta).

Mapping

bwa index -p filter_scaffold_anc_raw ../filter_scaffold_anc_raw.fasta Indexa o ordena los scaffolds para poder luego generar el archivo bam
-p les pone al todos los archivos creados el nombre filter_scaffold_anc_raw

bwa mem
Ejecuta el algoritmo BWA-MEM que crea el archivo SAM

• assemble/extra_info/filter_scaffold_anc_trimmed
  Prefijo de los archivos índice del genoma de referencia (los archivos generados previamente con bwa index).

• data/trimmed_data/evol1_R1.trimmed.fastq
  Archivo FASTQ con las lecturas de la hebra forward

• data/trimmed_data/evol1_R2.trimmed.fastq
  Archivo FASTQ con las lecturas de la hebra reverse

Samtools

samtools view -b -F 4 -q 30 mapping/aligned_raw_evol1.sam |
samtools sort -n -o mapping/trash.bam -

samtools fixmate -m mapping/trash.bam
mapping/trash.fixmate.bam

samtools sort -o - mapping/trash.fixmate.bam |
samtools markdup -r - mapping/filtered_aligned_raw_evol1.bam rm -rf mapping/trash*

• -b
  Genera la salida en formato BAM (binario), más eficiente para procesamiento.

• -F 4
  Excluye las lecturas con el flag 4, que indica lecturas no mapeadas.

• -q 30
  Excluye lecturas con calidad de mapeo menor a 30.

• Combinación de sort -n y fixmate:
  Ordena las lecturas por nombre para asegurar que pares estén juntos y corrige información del par, preparando los datos para la eliminación de duplicados.

• markdup -r
  Marca y remueve lecturas duplicadas.

• rm -rf mapping/trash*
  Elimina archivos temporales generados en el proceso.