一个细胞中或者一定含量的RNA中，含有转录本的数目就是表达量
| 检测方法 | 原理 | 实际应用 |
|---|---|---|
| qPCR（实时荧光定量） | PCR扩增过程中增加荧光信号的实时监测，看看每个循环产物数量的变化 | 常规基因表达验证（低通量） |
| Northern blotting | 放射性标记探针杂交 | 半定量分析（用于少量基因的定性）（低通量） |
| FISH（荧光原位杂交） | 在组织水平上利用目的蛋白的抗体检测表达 | 某个基因在特定组织中表达（低通量） |
| SAGE（基因表达系列分析） | 分析大量的EST（表达序列标签）寻找不同丰度的标签序列 | 分析样本量较多（中通量） |
| Microarray（表达芯片或者微阵列） | 将寡核苷酸探针固定在芯片上，然后将待测样本mRNA加上荧光标记与芯片杂交，然后通过分析荧光信号来监测表达量 | 高通量范围 |
| RNA-seq | 直接就是高通量测序，将个体的RNA序列测出然后用比对的方法鉴定表达量 | 高通量范围 |
RNA-seq表达量来源 大体是这样的：
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提取mRNA
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建库测序
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拿到一定的原始数据量raw data【双端x测序深度x建库大小，比如测序深度20X，双端150bpillumina测序，得到的数据就是2x150bpx20M=6G的数据量，但这个6G是碱基量，和硬盘占用空间的gigabytes(g)不一样哦
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质控过滤
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clean data
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研究物种是没有参考基因组的：从头组装转录本（de novo assembly）【工具包括：Trinity（可以预测更多的基因、转录本）；SOANdenovo-Trans（更好检测高表达转录本）；Oases（有效检测低表达基因以及长的亚型，N10-N50值高）】，然后再将reads比对到重装的转录本上，利用RSEM/Deseq2可以计算表达量
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研究物种是有参的，参考序列可以选基因组或者转录本，然后用featureCounts（推荐）/RSEM/htseq定量
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如果选基因组为参考，那么就要考虑到基因组含有的内含子和外显子。我们知道，转录的过程其实是把内含子去除了的，因此我们使用比对软件就要支持跨外显子拼接（exon-exon juction） 。最新的当属"Hisat2+Stringtie"，stringtie的merge算法会按照去掉内含子的基因组把所有样本的组装结果合并。
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如果选转录本为参考（前提：一般有基因组但不完整），那么转录本已经是去除内含子的序列了，因此计算压力就没那么大，比如常用的BWA、Bowtie2、STAR都可以；或者可以用非比对定量软件Sailfish【它原理是利用参考序列和k-mer长度建立索引，然后将reads直接比对到转录本，然后采用EM(Expectation maximazation，最大期望)算法估计转录本与基因极大似然估计】，这样只能对已知的转录本、基因定量，不能预测新的。
- 源自芯片的金标准Limma：芯片数据普遍认为符合正态分布 ，而正态分布的群体一般就是用t检验（两个样本）或者方差分析（多个样本）。芯片数据量是很大的，limma据此而生，并且支持多重检验校正来控制假阳性。limma采用贝叶斯模型（Empirical Bayesian model），更新的limma-voom适配了转录组数据
关于二项分布、泊松分布、正态分布的关系：
泊松分布，二项分布都是离散分布；正态分布是连续分布，方差分析其实就是看组内方差显著性与组间方差的对比，据此判断不同组（也就是不同样本）之间差异是否存在。
DESeq2：采用负二项分布算法（negative binomial distribution）
RNA-seq中，技术误差是满足泊松分布的，因为期望和方差差不多。但是生物学重复之间的误差不能用泊松分布来描述，因为他的方差可能很大，所以要用负二项分布
function package framework output DESeq2 input function summarizeOverlaps GenomicAlignments R/Bioconductor SummarizedExperiment DESeqDataSet featureCounts Rsubread R/Bioconductor matrix DESeqDataSetFromMatrix tximport tximport R/Bioconductor list of matrices DESeqDataSetFromTximport htseq-count HTSeq Python files DESeqDataSetFromHTSeq #如果是自己构建矩阵的话 library(DESeq2) exprSet <- as.matrix(原始表达量矩阵)# 每列表示一个样本，每行表示一个基因，必要时可以每行加上基因名 condition <- factor(c("control","case1","case2")) #表型 dds<- DESeqDataSetFromMatrix(countData = exprSet,colData = data.frame(condition),design = ~condition) dds <- dds[ rowSums(counts(dds)) > CUT, ] #【选做，表示过滤一部分count值低于CUT数字的数据，count自定义】 dds2<-DESeq(dds) #开始运行 result <- results() #查看结果 mcols(result, use.names = TRUE) #可以看每一个结果的意义，利用其中的指标可以画图 summary(result) #看总体结果，多少上调，多少下调【一般认为foldChange绝对值 > 1以及p value < 0.05就是差异基因】
DEseq2经过三部计算：estimateSizeFactors
、estimateDispersons、nbinomWaldTest
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DESeq2用自己的算法进行归一化： 第一步：
estimateSizeFactors计算每个样本的sizeFactor相关的过程是这样的：将原始表达量矩阵先进行log转换，然后计算每个基因在所有样本的均值rowMeans(log(raw_counts))，再将要计算的单个样本中每个基因的表达量减去前面的均值，再取中位数，就得到了sizeFactor； 第二步：有了每个样本的sizeFacor，再将样本原始表达量除以sizeFactor，就是归一化的表达量 -
edgeR: 使用
DEGList读取表达矩阵 利用(count-per-million，CPM）严格过滤count值低的数据calcNormFactors函数使用TMM算法对矩阵标准化 实验设计矩阵Design matrix，model.matrix(~0+group)估算离散值dispersionestimateDisp构建比较矩阵makeContrasts、glmQLFTest提取差异基因decideTestsDGE、glmTreat